トランスジェニックマウス(Tgマウス)作成における注意点

研究生活
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大学の実験でトランスジェニックマウス(Tgマウス)を作成することになりました。注意点について調べたのでまとめておきます。誰かのご参考になれば。

 

Tgマウス作成技術について

遺伝子の機能を個体レベルで解析する技術としてマウス個体へ遺伝子を導入する遺伝子改変マウス作成技術が有効である。遺伝子改変マウスは大きく二つに分けられ、目的のcDNAを含む外来遺伝子を、マウス受精卵に注射して個体における外来遺伝子の機能を解析するTgマウス、一方で特定の内差しせい遺伝子を外来性のDNA断片で置換することで元の遺伝子を欠損・変異させるノックアウトマウスがある。

 

今回はTgに関しての技術について説明する。Tgマウスの作成には一般的に前核期受精卵への外来遺伝子のマイクロインジェクションによる方法がとられる(今回もこの方法で作成を依頼する。)。マイクロインジェクション法は外来遺伝子をマウス受精卵の前核内に顕微鏡観察下でガラスピペットを用いて注入する。外来遺伝子を注入した受精卵は偽妊娠状態の仮親マウスの卵管内に移植して個体を作成する必要がある。

 

以上のことからTgマウスの作成には受精卵のマウス移植技術や体外受精などの発生工学的基盤技術が必要になる。詳しくは日薬理誌(Folia Pharmacol.Jpn.)129, 325-329(2017)を参照。

 

導入遺伝子の作成について注意点

  • 導入遺伝子は発現を制御する配列エンハンサー/プロモーター, イントロン, ポリA付加シグナルと発現させる配列(目的cDNA)を含んでいること
    →本実験ではプロモーターから目的遺伝子下流のSV polyA signal配列まで含める。
  • イントロンの挿入は導入遺伝子の発現量を高めることが知られている。
  • できるだけベクター部分を除き、線状化して使用する。ベクター部分を除くことで発現量を高まることが知られている。(環状でも使用できるが導入効率が低い)
    →線状化には制限酵素を用いて切断を行いゲル精製した。
  • 導入遺伝子の長さは数kbから数十kbまで可能である。BAC(Bacterial artificial chromosome)やYAP(Yeast artificial chromosome)では100-150kbまで可能である。
    →本実験では約8000bpとなる。
  • DNA溶液濃度は通常3-10ng/μLで使用される。

 

Tgマウスの特徴

  • 導入遺伝子は染色体状の1箇所にタンデムに数コピーがランダムに導入されるため、得られたTgマウスは全く系統の異なるマウスである。そのため複数系統のTgマウスの作成が必要である。
  • 通常導入遺伝子はメンデルの法則に従って安定して子孫に伝達される。
  • 導入遺伝子の組み込み位置によっては遺伝子の発現が抑制されたり、予定外の発現が認められたりするので注意が必要である。

 

 

Precautions in Creating Transgenic Mice (Tg Mice)

About the biotechnology to create Tg mice

As a technology to analyze the function of genes at the individual level, it is effective to create genetically modified mice by introducing genes into individual mice. Genetically modified mice can be divided into two types: Tg mice, in which a foreign gene containing the target cDNA is injected into a fertilized mouse egg to analyze the function of the foreign gene in the individual; and knockout mice, in which the original gene is deleted or mutated by replacing a specific internal gene with a foreign DNA fragment. On the other hand, there are knockout mice (KO mice), in which the original gene is deleted or mutated by replacing a specific inserted gene with an exogenous DNA fragment.

 

Tg mice are generally created by microinjection of exogenous genes into fertilized eggs at the anterior nucleus stage (this method is also used in our study). In the microinjection method, the exogenous gene is injected into the anterior nucleus of a mouse fertilized egg using a glass pipette under a microscope. The fertilized egg injected with the exogenous gene needs to be implanted into the oviduct of a pseudopregnant mouse to create an individual.

 

As described above, the creation of Tg mice requires basic developmental engineering technologies such as mouse transfer of fertilized eggs and in vitro fertilization. For details, please refer to Folia Pharmacol.Jpn.129, 325-329(2017).

 

Points to note about the creation of transgene

– The transgene must contain the sequence that controls expression: enhancer/promoter, intron, polyA addition signal, and the sequence to be expressed (target cDNA).

→In this experiment, we will include the promoter and the SV polyA signal sequence downstream of the target gene.

– The insertion of intron is known to increase the expression level of the transgene.

– The vector part should be removed as much as possible and used in linear form. It is known that removing the vector part increases the expression level. (The vector can be used in cyclic form, but the introduction efficiency is low.

→In this study, the length of the transgene is several kb.

– The length of the transgene can range from a few kb to several tens of kb, while BAC (Bacterial artificial chromosome) and YAP (Yeast artificial chromosome) can be up to 100-150 kb.

→In this experiment, the DNA solution is about 8,000 bp.

– The concentration of DNA solution is usually 3-10 ng/μL.

 

Characteristics of Tg mice

– Since the transgene is randomly introduced in several copies in tandem at one chromosomal location, the resulting Tg mice are completely different strains of mice. Therefore, it is necessary to create multiple strains of Tg mice.

– Normally, the transgene is stably transmitted to the offspring according to Mendelian laws.

– However, depending on the position of the transgene, the expression of the gene may be suppressed or unscheduled expression may be observed.

 

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